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養(yǎng)殖場病原診斷新技術(shù)—基因試紙卡

   日期:2025-05-01 11:29:00     來源:檢測     作者:中企檢測認(rèn)證網(wǎng)     瀏覽:28    評論:0
核心提示:畜禽養(yǎng)殖場作為動物疫病傳播的源頭,在疫病發(fā)生時及時進(jìn)行病原診斷,采取相應(yīng)的應(yīng)對措施,是目前動物疫病防

畜禽養(yǎng)殖場作為動物疫病傳播的源頭,在疫病發(fā)生時及時進(jìn)行病原診斷,采取相應(yīng)的應(yīng)對措施,是目前動物疫病防控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

目前國內(nèi)動物疫病的病原學(xué)診斷試劑選擇范圍有限。而在通用的血清學(xué)檢測試劑中,絕大多數(shù)是檢測血清中抗體的免疫試劑,其結(jié)果更多反應(yīng)了疫苗免疫效果,對病原感染只能間接分析,無法確診,何況動物在遭受感染后,病毒要在體內(nèi)潛伏一段時間,動物才會產(chǎn)生抗體,檢測結(jié)果往往滯后病原感染。能對野毒感染進(jìn)行鑒別的成熟抗體檢測試劑只有豬偽狂犬的gE抗體試劑盒,由于疫苗的純化工藝問題,口蹄疫的非結(jié)構(gòu)蛋白的抗體目前無法產(chǎn)生理論上的鑒別診斷作用。另一方面能監(jiān)測疫病病原的試劑的商品化試劑偏少。免疫熒光抗體技術(shù)受限于基層養(yǎng)殖場熒光顯微鏡以及熒光標(biāo)記抗體的缺乏,故在多數(shù)基層養(yǎng)殖試驗室難以普及。由于達(dá)到市場需求的特異性及靈敏度并能配對的動物疫病抗體的缺乏,免疫試劑中目前的病原檢測產(chǎn)品很少,這類產(chǎn)品開發(fā)的周期長,不確定性很大,很難應(yīng)對基層疫病防控的需要。因此養(yǎng)殖場試驗室亟需合適的病原學(xué)檢測試劑。

鑒于基于核酸擴(kuò)增的分子診斷技術(shù)發(fā)展迅速,熒光PCR及電泳PCR已經(jīng)被農(nóng)業(yè)部及各省市疫控單位逐步采用,扭轉(zhuǎn)了疫病診斷中病原診斷技術(shù)空白的態(tài)勢。但對養(yǎng)殖場基層試驗室來說,PCR分子診斷技術(shù)的使用存在不少阻礙:

1、分子診斷試劑一般要冷凍保存,成本高且運(yùn)輸半徑有限;

2、核酸提取步驟復(fù)雜緩慢,基層技術(shù)人員操作困難;

3、基層單位無力購買價格偏高的PCR擴(kuò)增儀,基層技術(shù)人員也不容易掌握儀器操作要領(lǐng)。因為這些難點(diǎn)的存在,分子診斷技術(shù)一直沒有在我國養(yǎng)殖基層試驗室普及。

快靈生物開發(fā)的基因試紙卡,開啟了現(xiàn)場分子診斷步入養(yǎng)殖場的新時代。它包括基因提取試劑、恒溫擴(kuò)增試劑及免疫層析試紙卡三部分,能常溫運(yùn)輸;在常溫下同時完成

DNA/RNA樣品提取,僅需微型離心機(jī)或?qū)@帕?0分鐘內(nèi)完成操作;添加樣品模板后將反應(yīng)管密閉后放置在變溫金屬浴上保溫60分鐘,擴(kuò)增完成后將反應(yīng)管插入試紙卡槽后一步按壓就啟動溶液層析,3-5分鐘后即可目視層析試紙的線條顯色判定結(jié)果。專利申請中的基因試紙卡解決了擴(kuò)增產(chǎn)物溶液及其氣溶膠的泄漏污染導(dǎo)致后續(xù)樣品交叉污染的問題,開啟了現(xiàn)場分子診斷步入了基層養(yǎng)殖場的新時代?;蛟嚰埧苤苯訖z測到病原,很適合對健康攜毒排毒的動物進(jìn)行篩查,也適合對感染早期的動物進(jìn)行確診,大大縮短窗口期。此外,對于罕見病原或突然爆發(fā)的新病原,只要能在基因庫中查詢到該病原的基因序列,基因試紙卡能最快在一周內(nèi)研發(fā)出來。該基因試紙卡的操作過程以專利磁力架,變溫金屬浴。

特點(diǎn)在于:
1.簡單快速提取核酸:快靈生物的核酸提取試劑在常溫下10分鐘內(nèi)能同時完成樣品中DNA與RNA的提取。目前基因變異最快,危害性最大的疫病往往都是RNA病毒引起的。其他商業(yè)化RNA病毒提取試劑一般要求在低溫冷凍條件下提取操作,基層單位往往無法實現(xiàn)。快靈生物經(jīng)過無數(shù)次的實驗摸索,終于配制了獨(dú)特的基因提取試劑,僅需微型高速離心機(jī)或?qū)@帕埽?0分鐘內(nèi)就能完成單份樣品的核酸提取。我們已經(jīng)在細(xì)菌病毒樣品,全血與組織樣品分別進(jìn)行了DNA、RNA的提取實驗,結(jié)果都很良好。簡單的RNA提取試劑是基因試紙卡步入基層應(yīng)用的基礎(chǔ)。
2. 擴(kuò)增核酸的高靈敏高特異的快速免疫檢測技術(shù):快靈生物通過膠體金試紙實現(xiàn)了基因擴(kuò)增產(chǎn)物的高靈敏高特異檢測。膠體金試紙具有極高的的檢測靈敏度,如克倫特羅的產(chǎn)品能達(dá)到納克級別(單位ng/ml),而基因擴(kuò)增技術(shù)則可以迅速將超痕量的靶基因特異擴(kuò)增百萬倍。快靈生物將膠體金技術(shù)與基因擴(kuò)增技術(shù)完美結(jié)合,實現(xiàn)了高靈敏的核酸檢測。我公司對照試驗表明,當(dāng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上呈現(xiàn)微弱信號時,快靈生物的基因試紙卡對稀釋100倍的擴(kuò)增產(chǎn)物仍有明顯信號。當(dāng)LAMP恒溫擴(kuò)增溶液采用染料(如SYBR Green I)只能檢測到微弱信號時,快靈生物基因試紙卡對100倍稀釋后的擴(kuò)增溶液仍有明顯信號。因此基因試紙卡能實現(xiàn)更高靈敏度的信號檢測,或者在同樣的產(chǎn)物濃度下,能保證更好的信號判別。更重要的是染料檢測方法沒有特異性,只要溶液中存在一定濃度的核酸就有信號,無法區(qū)分信號是來自特異性擴(kuò)增產(chǎn)物還是非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。而基因試紙卡的檢測則是引物與探針雙重保證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性,能很好地區(qū)分非特異擴(kuò)增產(chǎn)物。
3. 精致的防污染基因試紙卡:快靈生物專利申請中的防污染基因試紙卡,是目前解決基層單位基因擴(kuò)增產(chǎn)物污染的最佳方案。盡管在熒光定量PCR和LAMP等方法中,可以不開蓋檢測,但其使用的反應(yīng)管并沒有嚴(yán)格密封的結(jié)構(gòu)設(shè)計,滲漏與意外開蓋仍然可能導(dǎo)致污染??祆`生物專利申請中的防污染基因試紙卡的塑料套件中存在多級密封設(shè)計,并能承受一定的空氣壓力差,反應(yīng)管內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物被封存在試紙卡中,即使層析試紙上的擴(kuò)增產(chǎn)物形成了氣溶膠也無法擴(kuò)散出來。
4. 一步操作的核酸恒溫擴(kuò)增技術(shù):快靈生物采用了一步操作的核酸恒溫擴(kuò)增技術(shù),適合基層單位操作人員使用。近年開發(fā)出了多種恒溫擴(kuò)增技術(shù),有些技術(shù)需要進(jìn)行多步操作才實現(xiàn)核酸(DNA或RNA)的擴(kuò)增??祆`生物公司綜合了LAMP技術(shù)與RCA技術(shù)的特點(diǎn),獨(dú)創(chuàng)了新型的恒溫擴(kuò)增技術(shù),能一次添加相關(guān)試劑與樣品后,在50℃/64℃兩個溫度下共反應(yīng)60分鐘就能達(dá)到層析試紙需要的信號濃度。
5. 基因試紙卡的常溫運(yùn)輸:快靈生物的基因試紙卡檢測盒中的試劑與物料都能在常溫下運(yùn)輸,解決了基因檢測試劑對基層單位的物流障礙。目前絕大部分的基因檢測試劑都需要在-20℃的條件下采用干冰運(yùn)輸,使得產(chǎn)品的配送和使用極為不便。作為農(nóng)牧業(yè)的基層單位,出于疫病防控的需要,畜禽養(yǎng)殖場往往地處郊區(qū)或偏遠(yuǎn)的鄉(xiāng)村。基因檢測試劑的常溫運(yùn)輸,是基因檢測技術(shù)進(jìn)入這些基層單位的先決條件。快靈產(chǎn)品則采用獨(dú)有的保護(hù)劑,對檢測試劑中不易保存的成分進(jìn)行凍干固化,完全實現(xiàn)了產(chǎn)品的常溫運(yùn)輸,給廣大養(yǎng)殖場開啟了基因檢測技術(shù)的大門。
6. 最適應(yīng)基層人員使用的方案:快靈生物的基因試紙卡檢測盒的全流程操作簡單方便,即使中學(xué)文化人員經(jīng)簡單培訓(xùn)就能掌握。因此對廣大的基層單位客戶,采用基因試紙卡進(jìn)行疫病檢測,完全不需要額外招聘專業(yè)的技術(shù)人員。同時基因試紙卡所需配套儀器只有微型高速離心機(jī)或?qū)@帕?,變溫金屬浴和兩支移液槍,需要的配置費(fèi)用較低,絕大部分的基層單位都能負(fù)擔(dān)得起。

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