植物體內(nèi)的可溶性糖主要指能溶于水及乙醇的單糖和寡聚糖。苯酚法測(cè)定可溶性糖的原理是：糖在濃硫酸作用下，脫水生成的糠醛或羥甲基糠醛能與苯酚縮合成一種橙紅色化合物，在10～100μg范圍內(nèi)其顏色深淺與糖的含量成正比，且在485nm波長(zhǎng)下有最大吸收峰，故可用比色法在此波長(zhǎng)下測(cè)定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的測(cè)定，方法簡(jiǎn)單，靈敏度高，基本不受蛋白質(zhì)存在的影響，并且產(chǎn)生的顏色穩(wěn)定160min以上。
【儀器 與用具】
分光光度計(jì)；電爐；鋁鍋；20ml刻度試管；刻度吸管5ml 1支，1ml 2支；記號(hào)筆；吸水紙適量。
【試劑 】
1．90%苯酚溶液 稱取90g苯酚（AR），加蒸餾水10ml溶解，在室溫下可保存數(shù)月；
2．9%苯酚溶液 取3ml 90%苯酚溶液，加蒸餾水至30ml，現(xiàn)配現(xiàn)用；
3．濃硫酸（比重1.84）；
4．1%蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液 將分析純蔗糖在80℃下烘至恒重，精確稱取1.000g。加少量水溶解，移入100ml容量瓶中，加入0.5ml濃硫酸，用蒸餾水定容至刻度；
5．100μg/ml蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液 精確吸取1%蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液1ml加入100ml容量瓶中，加水定容。
【方法】
1．標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
取20ml刻度試管 11支，從0～10分別編號(hào)，按表24-1加入溶液和水。
表24-1 各試管 加溶液和水的量
|
管 號(hào) |
0 |
1～2 |
3～4 |
5～6 |
7～8 |
9～10 |
|
100μg/ml蔗糖液(ml) |
0 |
0.2 |
0.4 |
0.6 |
0.8 |
1.0 |
|
水(ml) |
2.0 |
1.8 |
1.6 |
1.4 |
1.2 |
1.0 |
|
蔗糖量(μg) |
0 |
20 |
40 |
60 |
80 |
100 |
然后按順序向試管內(nèi)加入1ml 9%苯酚溶液，搖勻，再?gòu)墓芤赫婵焖偌尤?ml濃硫酸，搖勻。比色液總體積為8ml，在恒溫下放置30min，顯色。然后以空白為參比，在485nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定，以糖含量為橫坐標(biāo)，光密為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出標(biāo)準(zhǔn)直線方程。
2．可溶性糖的提取
取新鮮植物葉片，擦凈表面污物，剪碎混勻，稱取0.10～0.30g，共3份，或干材料。分別放入3支刻度試管中，加入5～10ml蒸餾 水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液過(guò)濾入25ml容量瓶中，反復(fù)沖洗試管及殘?jiān)?，定容至刻度?/p>
3．測(cè)定 吸取0.5ml樣品液于試管中（重復(fù)2次），加蒸餾 水1.5ml，同制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟，按順序分別加入苯酚，濃硫酸溶液，顯色并測(cè)定光密度。由標(biāo)準(zhǔn)線性方程求出糖的量，按下式計(jì)算測(cè)試樣品中糖含量。
可溶性糖含量(mg/g)= [C×(V/a)×n]/(W×103)
式中 C－標(biāo)準(zhǔn)方程求得糖量(μg)；
a－吸取樣品液體積(ml)；
V－提取液量(ml)；
n －稀釋倍數(shù)；
W－組織重量（g）。
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