[實(shí)驗(yàn)?zāi)康腯
通過本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)DNA的限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)的基本原理與實(shí)驗(yàn)技術(shù)。
[實(shí)驗(yàn)原理]
1.限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA
序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上，并切割雙鏈DNA。它可分為三類:Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴于ATP
的存在。Ⅰ類酶結(jié)合于識別位點(diǎn)并隨機(jī)的切割識別位點(diǎn)不遠(yuǎn)處的DNA，而Ⅲ類酶在識別位點(diǎn)上切割DNA 分子，然后從底物上解離。Ⅱ類由兩種酶組成:
一種為限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)，它切割某一特異的核苷酸序列; 另一種為獨(dú)立的甲基化酶，它修飾同一識別序列。絕大多數(shù)Ⅱ類限制酶識別長度為4
至6個(gè)核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列(如EcoRⅠ識別六個(gè)核苷酸序列:5"-
G↓AATTC-3")，有少數(shù)酶識別更長的序列或簡并序列。Ⅱ類酶切割位點(diǎn)在識別序列中，有的在對稱軸處切割，產(chǎn)生平末端的DNA
片段(如Sma:5"-CCC↓GGG-3");有的切割位點(diǎn)在對稱軸一側(cè)，產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA 片段稱粘性未端，
如EcoRⅠ切割識別序列后產(chǎn)生兩個(gè)互補(bǔ)的粘性末端。 5"…G↓AATTC…3" →5"…G AATTC…3" ；3"…CTTAA↑G …5" →3"…CTTAA
G…5"
2.DNA 純度、緩沖液、溫度條件及限制性內(nèi)切酶本身都會(huì)影響限制性內(nèi)切酶的活性。大部分限制性內(nèi)切酶不受RNA 或單鏈DNA
的影響。當(dāng)微量的污染物進(jìn)入限制性內(nèi)切酶貯存液中時(shí)，會(huì)影響其進(jìn)一步使用，因此在吸取限制性內(nèi)切酶時(shí)，每次都要用新的吸管頭。如果采用兩種限制性內(nèi)切酶，必須要注意分別提供各自的最適鹽濃度。若兩者可用同一緩沖液，則可同時(shí)水解。若需要不同的鹽濃度，則低鹽濃度的限制性內(nèi)切酶必須首先使用，隨后調(diào)節(jié)鹽濃度，再用高鹽濃度的限制性內(nèi)切酶水解。也可在第一個(gè)酶切反應(yīng)完成后，用等體積酚/氯仿抽提，加0.1倍體積3mol/LNaAc
和2倍體積無水乙醇，混勻后置于-70℃低溫冰箱內(nèi)30 分鐘，離心、干燥并重新溶于緩沖液后進(jìn)行第二個(gè)酶切反應(yīng)。
3.DNA 限制性內(nèi)切酶酶切圖譜又稱DNA 的物理圖譜，它由一系列位置確定的多種限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)組成，以直線或環(huán)狀圖式表示。構(gòu)建DNA
限制性內(nèi)切酶圖譜有許多方法。通常結(jié)合使用多種限制性內(nèi)切酶，通過綜合分析多種酶單切及不同組合的多種酶同時(shí)切所得到的限制性片段大小來確定各種酶的酶切位點(diǎn)及其相對位置。酶切圖譜的使用價(jià)值依賴于它的準(zhǔn)確性和精確程度。在酶切圖譜制作過程中，為了獲得條帶清晰的電泳圖譜，一般DNA
用量約為0.5-1μg。限制性內(nèi)切酶的酶解反應(yīng)最適條件各不相同，各種酶有其相應(yīng)的酶切緩沖液和最適反應(yīng)溫度(大多數(shù)為37℃)。對質(zhì)粒DNA 酶切反應(yīng)而言，
限制性內(nèi)切酶用量可按標(biāo)準(zhǔn)體系1μg DNA 加1 單位酶，消化1-2 小時(shí)。但要完全酶解則必須增加酶的用量，一般增加2-3
倍，甚至更多，反應(yīng)時(shí)間也要適當(dāng)延長。
[實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備]
水平式電泳裝置，電泳儀，臺(tái)式高速離心機(jī)， 恒溫水浴鍋， 微量移液槍， 微波爐，紫外透射儀，照相系統(tǒng)
[實(shí)驗(yàn)材料]
λDNA; 重組pBS 質(zhì)料或pUC19 質(zhì)粒; EcoRI 酶及其酶切緩沖液; HindⅢ酶及其酶切緩沖液;瓊脂糖(Agarose)。
附試劑的配制：
1、 5×TBE 電泳緩沖液：見實(shí)驗(yàn)二。
2、 6×電泳載樣緩沖液：見實(shí)驗(yàn)二。
3、 溴化乙錠：見實(shí)驗(yàn)二。
[實(shí)驗(yàn)步驟]
1.將清潔干燥并經(jīng)滅菌的eppendorf 管(最好0.5ml)編號，用微量移液槍分別加入DNA1μg
和相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶反應(yīng)10×緩沖液2μl，再加入重蒸水使總體積為19μl，將管內(nèi)溶液混勻后加入1μl 酶液，用手指輕彈管壁使溶液混勻，也可用微量離心機(jī)甩一
下，使溶液集中在管底。
2. 混勻反應(yīng)體系后，將eppendorf 管置于適當(dāng)?shù)闹С治锷希ㄈ绮逶谂菽芰习迳希?7℃水浴保溫2-3 小時(shí)，使酶切反應(yīng)完全。
3.每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0)，混勻，以停止反應(yīng)，置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
4.制備瓊脂糖凝膠分析內(nèi)切酶酶切反應(yīng)結(jié)果
配制1.5%瓊脂糖凝膠，取10μl 酶解液與2μl
6×載樣液混勻電泳。保持電壓在60-80V，電流在40mA.電泳結(jié)束后，用EB染色20-25min，紫外燈下觀察結(jié)果。
[作業(yè)]
根據(jù)紫外燈下觀察的結(jié)果，畫出電泳示意圖，并討論內(nèi)切酶酶切反應(yīng)應(yīng)注意的事項(xiàng)。
[實(shí)驗(yàn)安排]
6學(xué)時(shí)1天內(nèi)可完成，上午做內(nèi)切酶酶切反應(yīng)，下午做電泳檢測。
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