支原體（霉形體）的培養(yǎng)技巧支原體是介于病毒與細(xì)菌之間的一類微生物，在自然界廣泛存在，使人和多種動物、植物害病。
它缺乏細(xì)胞壁而不同于細(xì)菌，能在無細(xì)胞培養(yǎng)基生長繁殖，并含有RNA和DNA而有別于病毒。支原體以二分裂方式繁殖，基本形態(tài)為圓形、絲狀形，后者易形成分枝狀菌絲，因而得名支原體。其大小介于病毒和細(xì)菌之間，最小直徑125-250nm，可通過濾器。基因組小只5×108道爾頓，是已知能自行復(fù)制繁殖的原核生物中最小的，因而生物合成能力低，體外培養(yǎng)時(shí)需要富含營養(yǎng)，如血清、酵母浸液、核酸等復(fù)雜成分的培養(yǎng)基才能生長。它生長緩慢，倍增時(shí)間1-6小時(shí)，最長需三周才形成菌落。菌落中心長入瓊脂內(nèi)部形成中央較密的核，從上方觀察可見“煎蛋樣”的特殊菌落，因?yàn)榫浜苄⌒柙诘捅剁R下才能看見。Mp從發(fā)酵葡萄糖取得生長所需能量。Uu則是通過水解尿素獲得能量。支原體對抑制細(xì)胞壁合成的青霉類抗生素不敏感，對抑制蛋白質(zhì)合成的抗生素如四環(huán)素和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的紅霉素等敏感。
一般培養(yǎng)比較多的是肺炎支原體（MP），解脲脲原體(UU）是耐酸不耐堿的，UU培養(yǎng)的原理是在于其菌體中含有脲酶，而UU培養(yǎng)基中含有尿素，UU的生長需要其本身的脲酶分解尿素益提供其自身生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，UU培養(yǎng)基中含有指示劑酚紅，由于尿素被分解釋放出氨從而使培養(yǎng)基變堿而使培養(yǎng)基由黃變紅，但是這種紅是一種清亮的紅色，透明澄清無渾濁，UU其適宜的PH值為6.2-6.5，由于尿素分解產(chǎn)氨是PH上升，UU在PH值大于7的條件下會迅速死亡，因此，在培養(yǎng)時(shí)要隨時(shí)觀察其液體培養(yǎng)基的PH值，一旦看到培養(yǎng)基變紅，要立即取出，以防培養(yǎng)基PH上升導(dǎo)致UU死亡，一般UU需要在培養(yǎng)至對數(shù)生長期時(shí)是活力最強(qiáng)的時(shí)候（培養(yǎng)基呈橙紅色變化）。一般UU生長需要24小時(shí)。
UU的計(jì)數(shù)也和普通細(xì)菌不同，采用顏色單位改變法（CCU法），因?yàn)閁U的生長是澄清清亮透明的，因此無法用一般的比濁法來計(jì)數(shù)！
UU的保存：在UU生長到對數(shù)生長期時(shí)，采用甘油保存法，甘油和菌液的比例為3：7，（甘油高壓滅菌），采用程序降溫法，獻(xiàn)4度1小時(shí)，在－20度2小時(shí)，最后放到－80度，但是在－80度最長不要超過半年，因此需要每隔2－3個月將菌株復(fù)蘇一次到對數(shù)生長期后再保存！
另外，UU生長所需要的培養(yǎng)基的成分一般每隔單位有所不同，但是有一點(diǎn)肯定，就是需要小牛血清。
器具泡酸的目的是為了去除雜質(zhì)，一般在做細(xì)胞培養(yǎng)是需要泡酸，做細(xì)菌方面的工作要求不需要如此嚴(yán)格的，只需要洗干凈，高壓消毒就可以了，在配培養(yǎng)基時(shí)用的是三蒸水，把培養(yǎng)基配好后，最后再加入血清，然后調(diào)到所需的PH值，不可以高壓，只能用0.22um的濾膜過濾除菌！培養(yǎng)基配好后，4度放半年沒問題！
沒有從動物身上分離UU，但是剛一開始做時(shí)，是從病人的臨床分泌物中分離，臨床分離株需要純化，因?yàn)榕R床株常常含有很多雜質(zhì)，這些雜質(zhì)會影響UU的生長，導(dǎo)致UU的CCU常常達(dá)不到10的3次方，因此對臨床株需要純化，可以在固體平板上見到油煎蛋樣菌落，用滅菌小刀切取菌落瓊脂塊，移入液體培養(yǎng)基中壓碎進(jìn)行培養(yǎng)，等到培養(yǎng)基變黃后，用液體培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)物到10的-4或-5次方，再取0.2-0.4ml于固體平板上，這樣反復(fù)2-3次，就可以得到支原體的純種。
CCU一方面和細(xì)菌本身濃度有關(guān)，另一方面，確實(shí)與培養(yǎng)基成分有很大關(guān)系，如果培養(yǎng)基營養(yǎng)成分差，很難作出來，如果培養(yǎng)基中只含有鹽成分的話，高壓是沒問題的，如LB培養(yǎng)基，但是如果里面含有小牛血清或糖類等物質(zhì)的話，絕對不可以高壓，因?yàn)檫@樣會破壞營養(yǎng)成分，只可以過濾除菌！
解脲脲原體培養(yǎng)基配制：（在自制培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加：）PH：6。13
小牛血清：30ml/250ml
10％尿素：12 ml/250ml
0．2％酚紅：4。5 ml/250ml
青霉素G：50萬U/250ml
酵母：6。25 g/250ml
磷酸二氫鉀：0。375 g/250ml
天門冬素：0。025 g/250ml
自制培養(yǎng)基包括：新鮮牛肉浸液：90毫升
蛋白胨：1克
氯化鈉：0。5克
磷酸二氫鉀：0。15克
（此自制培養(yǎng)基可以高壓滅菌）。
加瓊脂配成固體，一般1％即可！
支原體是能夠在無生命培養(yǎng)基上生長的最小微生物，其生長特點(diǎn)是在液基中是清亮的，因此他的計(jì)數(shù)無法通過比濁法，其對數(shù)生長期在液體中的表現(xiàn)是表現(xiàn)為橙紅色，這是支原體的代謝活力旺盛，如果顏色呈現(xiàn)桃紅色或深紅色，這時(shí)UU的活力就會下降，因?yàn)閁U的最合適PH為6.0-6.5,這時(shí)培養(yǎng)基的PH偏堿，UU可能已死亡。為了區(qū)分顏色，可以用一管液體培養(yǎng)基作為顏色改變對照，黃色和橙紅色還是比較好區(qū)分的！
Uu的最適生長PH在6.0－6.1之間，這可能與培養(yǎng)基的配制有關(guān)。關(guān)于Uu的計(jì)數(shù)，CCu是最好的方法：200ul菌液加入第一瓶1.8ml液態(tài)培養(yǎng)基中混勻，然后從中取出200ul加入第二瓶1.8ml液體培養(yǎng)基中，混勻，以此類推，10倍稀釋11瓶，做3組平行試驗(yàn)，求平均值即可。注意，每步操作都要換槍頭。
對于Uu的保存，其實(shí)方法也很簡單：
1、用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)15－17h（溶液有桔黃色變?yōu)槌燃t色，而且基本在對數(shù)生長期左右），直接放入0度或－20度，2個月是沒問題的，如果不放心的話，可隔一個月檢查一下活性。
2、如果條件允許的話，可將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的陽性液先預(yù)凍，然后抽真空即可。保存幾年是沒問題的。復(fù)蘇的時(shí)候，直接向其中加入U(xiǎn)u培養(yǎng)基培養(yǎng)即可。
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